ព័ត៌មាន

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) គឺជា analogue នៃស្រទាប់ខាងក្រោម β-galactosidase ដែលមិនអាចទទួលយកបានខ្ពស់។នៅក្រោមការបញ្ចូលនៃ IPTG អាំងឌុចទ័រអាចបង្កើតស្មុគស្មាញជាមួយប្រូតេអ៊ីន repressor ដូច្នេះការអនុលោមតាមប្រូតេអ៊ីន repressor ត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរ ដូច្នេះវាមិនអាចត្រូវបានផ្សំជាមួយហ្សែនគោលដៅ ហើយហ្សែនគោលដៅត្រូវបានបង្ហាញយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាព។ដូច្នេះតើកំហាប់នៃ IPTG គួរតែត្រូវបានកំណត់យ៉ាងដូចម្តេចក្នុងអំឡុងពេលពិសោធន៍?ធំជាង កាន់តែល្អ?
ជាដំបូង ចូរយើងយល់ពីគោលការណ៍នៃ IPTG induction: E. coli's lactose operon (element) មានផ្ទុកហ្សែនរចនាសម្ព័ន្ធបីគឺ Z, Y និង A ដែលអ៊ិនកូដ β-galactosidase, permease, និង acetyltransferase រៀងគ្នា។lacZ hydrolyzes lactose ទៅជាគ្លុយកូសនិង galactose ឬចូលទៅក្នុង allo-lactose;lacY អនុញ្ញាតឱ្យ lactose នៅក្នុងបរិស្ថានឆ្លងកាត់ភ្នាសកោសិកាហើយចូលទៅក្នុងកោសិកា;lacA ផ្ទេរក្រុម acetyl ពី acetyl-CoA ទៅ β-galactoside ដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការដកឥទ្ធិពលជាតិពុល។លើសពីនេះទៀតមានលំដាប់ប្រតិបត្តិការ O លំដាប់ចាប់ផ្តើម P និងហ្សែននិយតកម្ម I. កូដហ្សែន I គឺជាប្រូតេអ៊ីនដែលអាចទប់ទល់នឹងទីតាំង O នៃលំដាប់ប្រតិបត្តិករ ដូច្នេះ operon (មេតា) ត្រូវបានសង្កត់ និង បិទ។វាក៏មានកន្លែងចងសម្រាប់ catabolic gene activator site binding protein-CAP នៅផ្នែកខាងលើនៃលំដាប់ចាប់ផ្តើម P. លំដាប់ P, O sequence និង CAP binding site រួមគ្នាបង្កើតជាតំបន់បទប្បញ្ញត្តិនៃ lac operon ។ហ្សែនសរសេរកូដនៃអង់ស៊ីមទាំងបីត្រូវបានគ្រប់គ្រងដោយតំបន់និយតកម្មដូចគ្នា ដើម្បីសម្រេចបាននូវការបញ្ចេញមតិសំរបសំរួលនៃផលិតផលហ្សែន។

អវត្ដមាននៃជាតិ lactose, lac operon (meta) ស្ថិតនៅក្នុងស្ថានភាពនៃការបង្ក្រាប។នៅពេលនេះ lac repressor ដែលបង្ហាញដោយលំដាប់ I ក្រោមការគ្រប់គ្រងនៃ PI prosequence sequence ភ្ជាប់ទៅនឹង O sequence ដែលការពារ RNA polymerase ពីការចងទៅនឹង P sequence និងរារាំងការចាប់ផ្តើមចម្លង។នៅពេលដែលមានជាតិ lactose នោះ lac operon (meta) អាចត្រូវបានជំរុញនៅក្នុងប្រព័ន្ធ operon (meta) នេះ សារធាតុ inducer ពិតប្រាកដមិនមែនជា lactose ទេ។Lactose ចូលទៅក្នុងកោសិកា ហើយត្រូវបានបំប្លែងដោយ β-galactosidase ដើម្បីបំប្លែងទៅជា allolactose ។ក្រោយមកទៀតជាម៉ូលេគុល inducer ភ្ជាប់ទៅនឹងប្រូតេអ៊ីន repressor និងផ្លាស់ប្តូរការអនុលោមតាមប្រូតេអ៊ីនដែលនាំឱ្យមានការបំបែកនៃប្រូតេអ៊ីន repressor ពីលំដាប់ O និងការចម្លង។Isopropylthiogalactoside (IPTG) មានឥទ្ធិពលដូចគ្នានឹង allolactose ដែរ។វាគឺជា inducer ដែលមានអនុភាពខ្លាំង ដែលមិនត្រូវបានរំលាយដោយបាក់តេរី និងមានស្ថេរភាពខ្លាំង ដូច្នេះវាត្រូវបានគេប្រើយ៉ាងទូលំទូលាយនៅក្នុងមន្ទីរពិសោធន៍។

តើធ្វើដូចម្តេចដើម្បីកំណត់កំហាប់ល្អបំផុតនៃ IPTG?យក E. coli ជាឧទាហរណ៍។
ពូជ E. coli BL21 ដែលត្រូវបានកែច្នៃដោយហ្សែនដែលមាន pGEX វិជ្ជមាន recombinant (CGRP/msCT) ត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុករាវ LB ដែលមាន 50μg·mL-1 Amp ហើយត្រូវបានដាំដុះពេញមួយយប់នៅសីតុណ្ហភាព 37°C។វប្បធម៌ខាងលើត្រូវបានចាក់ចូលទៅក្នុងដប 10 នៃ 50mL សារធាតុរាវ LB ស្រស់ដែលមានផ្ទុក 50μg·mL-1 Amp ក្នុងសមាមាត្រនៃ 1:100 សម្រាប់វប្បធម៌ពង្រីក ហើយនៅពេលដែលតម្លៃ OD600 គឺ 0.6~0.8 IPTG ត្រូវបានបន្ថែមទៅការប្រមូលផ្តុំចុងក្រោយ។វាគឺ 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 ។បន្ទាប់ពីការបញ្ចូលនៅសីតុណ្ហភាពដូចគ្នា និងក្នុងពេលតែមួយ 1 mL នៃដំណោះស្រាយបាក់តេរីត្រូវបានយកចេញពីវា ហើយកោសិកាបាក់តេរីត្រូវបានប្រមូលដោយ centrifugation និងត្រូវបានដាក់ឱ្យ SDS-PAGE ដើម្បីវិភាគឥទ្ធិពលនៃកំហាប់ IPTG ផ្សេងៗគ្នាលើការបញ្ចេញប្រូតេអ៊ីន ហើយបន្ទាប់មក ជ្រើសរើសកំហាប់ IPTG ជាមួយនឹងកន្សោមប្រូតេអ៊ីនធំបំផុត។
បន្ទាប់ពីការពិសោធន៍វានឹងត្រូវបានរកឃើញថាកំហាប់នៃ IPTG មិនធំតាមដែលអាចធ្វើបាន។នេះគឺដោយសារតែ IPTG មានជាតិពុលជាក់លាក់ចំពោះបាក់តេរី។លើសពីកំហាប់នឹងសម្លាប់កោសិកា។ហើយជាទូទៅយើងសង្ឃឹមថាប្រូតេអ៊ីនរលាយកាន់តែច្រើនដែលបង្ហាញនៅក្នុងកោសិកាកាន់តែល្អ ប៉ុន្តែក្នុងករណីជាច្រើននៅពេលដែលកំហាប់ IPTG ខ្ពស់ពេក បរិមាណដ៏ច្រើននៃការរួមបញ្ចូលនឹងត្រូវបានបង្កើតឡើង។រាងកាយប៉ុន្តែបរិមាណប្រូតេអ៊ីនរលាយបានថយចុះ។ដូច្នេះ ការផ្តោតអារម្មណ៍ IPTG ដែលសមស្របបំផុត ច្រើនតែមិនធំជាងនេះទេ ប៉ុន្តែការផ្តោតអារម្មណ៍កាន់តែទាប។
គោលបំណងនៃការបង្កើត និងការដាំដុះនៃពូជដែលកែច្នៃដោយហ្សែនគឺដើម្បីបង្កើនទិន្នផលប្រូតេអ៊ីនគោលដៅ និងកាត់បន្ថយការចំណាយ។កន្សោមនៃហ្សែនគោលដៅគឺមិនត្រឹមតែត្រូវបានប៉ះពាល់ដោយកត្តាផ្ទាល់របស់សំពាធ និងកន្សោម plasmid ប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងដោយលក្ខខណ្ឌខាងក្រៅផ្សេងទៀត ដូចជាការផ្តោតអារម្មណ៍របស់ inducer សីតុណ្ហភាព induction និង induction time។ដូច្នេះ ជាទូទៅ មុនពេលប្រូតេអ៊ីនដែលមិនស្គាល់មួយត្រូវបានបង្ហាញ និងបន្សុត វាជាការល្អបំផុតក្នុងការសិក្សាអំពីពេលវេលា សីតុណ្ហភាព និងកំហាប់ IPTG ដើម្បីជ្រើសរើសលក្ខខណ្ឌសមស្រប និងទទួលបានលទ្ធផលពិសោធន៍ល្អបំផុត។